Evaluación de la reinervación funcional y sobrevivencia neuronal

 

1) Pruebas neuroquímicas

El contenido de dopamina en varios núcleos cerebrales lo medimos por HPLC de fase reversa con detección electroquímica [20,33] y la liberación de dopamina la cuantificamos por medio de microdiálisis cerebral acoplada a HPLC de fase reversa con detección electroquímica [33]. En la misma corrida cromatográfica podemos cuantificar los catabolitos DOPAC y HVA para estimar la transmisión dopaminérgica.

Disponemos de la técnica de unión ligando radioactivo-receptor (binding) para evaluar los receptores a neurotransmisores en homogenizados del varios núcleos cerebrales [46].  También podemos evaluar la unión ligando radioactivo-receptor por autoradiografía cuantitativa [16,20].

2) Estudios inmunohistológicos

Contamos con las técnicas de inmuofluorescencia indirecta o imunohistoquímica contra tirosina hidroxilasa para identificar las neuronas dopaminérgicas y su inervación [1,20,30,31,39]. También utilizamos estas técnicas para identificar la expresión de los transgenes para hGDNF-myc o BDNF-flag. Además, podemos cuantificar por ELISA los niveles de factores tróficos u otra proteína de interés [31,32]. Nuestra experiencia en análisis de imágenes nos permite hacer sobreposición de imágenes, cuantificar la densidad de la fluorescencia o de la marca inmunohistoquímica, y contar poblaciones celulares reveladas con técnicas inmunológicas o histopatológicas.

 3) Estudios moleculares

Tenemos la tecnología para evaluar la expresión de cualquier proteína a nivel postranscripcional (Western Blot) como transcripcional (Northern Blot y RT-PCR). Recientemente hemos adquirido un aparato de PCR en tiempo real para cuantificar el mRNA de diferentes genes que tienen interés terapéutico, tales como GDNF o BDNF. Utilizando esta técnica queremos evaluar el nivel de control de genes de sistemas regulables que estamos utilizando para dosificar la expresión de los transgenes terapéuticos [7,16,19,20,31]. Para la elaboración de los sistemas de expresión y de regulación de transgenes contamos con la colaboración de la  Dra. Refugio García-Villegas, profesora de nuestro Departamento, y del Dr. Michael J. Bannon, profesor de Wayne State University, USA.